Nobelovu cenu za chemii za rok 2020 obdržely Jennifer Doudna a Emmanuelle Charpentier za vývoj revoluční, avšak jednoduché metody pro úpravu DNA, známé jako CRISPR/Cas9. Tato technologie umožňuje specifickou úpravu primární sekvence DNA na přesně definovaném cílovém místě, například v místě mutace způsobující genetické onemocnění. Cílové místo je v genomu identifikováno díky komplementaritě naváděcí gRNA a nukleasa Cas9 provádí zlom v obou řetězcích dvoušroubovice DNA, čím umožňuje editaci. CRISPR/Cas9 je nyní široce používán vědci po celém světě, i přesto je přesnost této metody pro cílenou editaci v živých buňkách neustále zdokonalována. Jsou vyvíjeny nové nástroje a modifikace enzymů, které umožňují úpravy DNA například bez dvouvláknových zlomů.

Společný výzkum vědců z Japonska a USA odhalil prostorovou strukturu a molekulární mechanismy nástroje pro úpravu genů, zvaného „prime editor“ a svoje výsledky publikoval v prestižním časopise Nature. Tzv. prime editor kombinuje protein SpCas9, používaný v první generaci technologie CRISPR/Cas9 pro úpravu genů, s enzymem reverzní transkriptasou (RT), který přepisuje RNA na DNA. Prime editor umožňuje reverzní transkripci bez zlomu obou řetězců DNA, což vede k přesné záměně bází nebo ke krátkým insercím a delecím v cílové sekvenci DNA. Cílové místo editace je vybráno pomocí speciální naváděcí RNA (pegRNA, prime editing guide RNA), která přesně identifikuje cílovou sekvenci v DNA a celý komplex pak zakóduje požadovanou editaci. Prime editor tedy funguje podobně jako textový procesor genů, nahrazuje genetickou informaci na vybraném místě genomu. Tento nástroj byl již úspěšně aplikován v živých buňkách organismů, jako jsou rostliny, rybičky dánia či myši. 

Přesný mechanismus, kterým tento molekulární komplex provádí každý krok úpravy, je intenzivně studován. K objasnění je třeba porozumět jeho prostorové struktuře. Konkrétně ve studii publikované v květnu 2024 byla zkoumána prostorová struktura systému prime editoru, složenému z nikasy bakterie Streptococcus pyogenes Cas9 (nSpCas9) a virové reverzní transkriptasy (M-MLV RT). 

Publikované výsledky struktury tohoto editačního komplexu přispěly k lepšímu pochopení molekulárního mechanismu reverzní transkripce řízené pegRNA prime editorem. Výzkumný tým z Tokijské univerzity a Broad Institutu použil kryogenní elektronovou mikroskopii (cryo-EM) s atomovým rozlišením, čímž úspěšně určil jeho trojrozměrnou strukturu. 

Analýza odhalila, že reverzní transkriptasa zůstává v konstantní poloze vůči proteinu Cas9, což může vést k nežádoucím insercím, byly pozorovány změny o jednu až tři báze. Strukturální a biochemické analýzy rovněž ukázaly, že M-MLV RT může prodlužovat reverzní transkripci za očekávané místo, což způsobuje tyto nežádoucí úpravy v cílových sekvencích. Strukturální srovnání mezi stavy před iniciací, iniciací a elongací ukazuje, že M-MLV RT zůstává během reverzní transkripce v konzistentní poloze vzhledem k nSpCas9, zatímco heteroduplex DNA syntetizovaný pegRNA se hromadí podél povrchu nikasy SpCas9. Na základě těchto strukturálních pozorování autoři studie zkonstruovali různé varianty pegRNA a prime editoru a testovali jejich strukturu a funkci. Díky těmto novým poznatkům můžeme lépe porozumět mechanismům úpravy genů a vytvářet přesnější nástroje pro genovou terapii. Publikovaná zjištění poskytují strukturální pohledy na postupný mechanismus editace a připravují cestu pro vývoj univerzálních nástrojů pro budoucí aplikace, včetně genových terapií.

Strategie určování struktury, popsaná ve studii publikované Yutaro Shuto a kolegy, může být aplikována na další navrhované technologie pro úpravu genů, zejména na editory kombinující různé varianty Cas9 a reverzní transkriptasy. Získané strukturální informace jsou klíčové pro vývoj vylepšených nástrojů pro editaci genů a mají významný potenciál pro návrh přesných nástrojů pro genovou terapii.

Zdroje: 

• https://www.nature.com/articles/s41586-024-07497-8
• https://www.isaaa.org/kc/cropbiotechupdate/article/default.asp?ID=20846
• https://www.s.u-tokyo.ac.jp/en/press/10375/

Zdroj článku: BIOTRIN