Informace organizace BIOTRIN – Jak jste již možná slyšeli, jednou z nejpoužívanějších metod pro úpravu genové informace je systém využívající CRISPR-Cas9 technologii. Tento systém, sloužící původně jako imunitní systém bakterií bránících se proti cizorodé DNA, umožňuje rychlou, cenově dostupnou a poměrně přesnou editaci cílových genů. Širšímu použití této metody např. v medicíně však doposud bránil nezanedbatelný výskyt nechtěných mutací a výsledná cytotoxicita. A právě na potlačení vzniku těchto nechtěných mutací se zaměřil tým vědců z Kyushu University a Nagoya University School of Medicine (Japonsko). 

Klasický CRISPR-Cas9 systém využívá endonukleázu Cas9 fungující jako molekulární nůžky umožňující štěpení DNA ve specifickém místě, na které jej naviguje syntetická „guide“ RNA (gRNA). Tento systém umožňuje geny jak vyřazovat, tak vnášet, či měnit jejich sekvenci. V medicíně se jako nejperspektivnější jeví tzv. oprava na základě homologie, kdy se vadná kopie genu opraví podle správného templátu přítomného např. na sesterské chromatidě nebo na vneseném plazmidu. K opravě dochází na základě homologní rekombinace, ke které je nutné nejprve cílovou DNA na správném místě rozštěpit. A k tomu slouží právě CRISPR-Cas9. Vzhledem k malé velikosti gRNA (obvykle 17-24 párů bazí) však může docházet k chybnému zacílení systému na oblast genomu se sekvencí podobnou cílovému genu, čímž pak dojde ke vzniku oné nechtěné mutace. Změna genů navíc může vést k mutacím na úrovni chromozomu, což bylo patrně důvodem neúspěšných klinických studií zaměřených na využití CRISPR-Cas9 technologie pro léčbu rakoviny a svalové dystrofie. Výše zmíněný tým přišel s hypotézou, že za neúspěch může přehnaná aktivita CRISPR-Cas9, která po vyvolání specifických DNA zlomů začíná vlákno dále štěpit nespecificky. 

Aby mohli vědci tuto hypotézu otestovat, vyvinuli nejprve v myších buňkách systém pojmenovaný AIMS, který jim umožnil vyhodnotit aktivitu endonukleázy Cas9 u jednotlivých chromozomů. Díky tomu zjistili, že klasický CRISPR-Cas9 sytém skutečně vykazuje vysokou editační aktivitu, která může vést k rozvoji nechtěných vedlejších účinků. Pokusili se tedy systém modifikovat tak, aby mohla být jeho aktivita regulovaná. 

Tajemství spočívalo v zavedení extra cytosinu na 5‘ konec gRNA, který slouží jako pojistka bránící nekontrolovatelnému štěpení DNA. Použitím takto modifikované „safeguard“ gRNA ([C]gRNA) se vědcům povedlo snížit výskyt nechtěných mutací a cytotoxicitu, a zároveň zvýšit efektivitu selektivní editace alel i výše zmíněných oprav založených na homologii. Metodu se jim podařilo otestovat také v praxi na myším modelu, kdy s její pomocí opravili chybnou alelu zodpovědnou za rozvoj vzácného onemocnění fibrodysplasia ossificans progressiva, a to s přesností jednoho nukleotidu. Kromě toho se jim také povedlo vyvinout první matematický model předpovídající výsledek editace genů s danými parametry. Není tedy divu, že výzkum publikovali v prestižním časopise Nature Biomedical Engineering. 

V současnosti se vědecká skupina zaměřuje na rozšíření nové platformy zaměřené na editaci genů. Safeguard RNA totiž funguje i v jiných CRISPR systémech, např. využívajících endonukleázu Cas12a. Kromě toho dále testují efektivitu a bezpečnost použití [C]gRNA u dalších onemocnění, a to na buněčných liniích a zvířecích modelech. Autoři studie doufají, že tak pomohou vyvinout terapeutika a metody genové terapie umožňující mimo jiné léčbu vzácných a v současné době neléčitelných onemocnění. A nám nezbývá než doufat spolu s nimi.  

Zdroje:

• https://www.nature.com/articles/s41551-023-01011-7 
• https://scitechdaily.com/fewer-unwanted-mutations-new-technique-opens-the-door-to-safer-gene-editing/

Zdroj článku: BIOTRIN