Moderní metody zjišťování patogenů
Vydáno: 9. 6. 2011
Autor: Ing. Irena Suková
Pro rychlou a snadnou detekci patogenních mikrobů jsou vyvíjeny metody založené na PCR, na měření spotřeby kyslíku a na světelné emisi.
Systémy založené na PCR (polymerázová řetězová reakce)
Společnost Life Technologies (Kalifornie) oznámila první využití PCR-metody při stanovení Salmonella enteritidis ve vejcích. Podle posudku amerického úřadu FDA je test „Applied Biosystems TaqMan® Salmonella Enteritidis Detection Kit“ přesností, reprodukovatelností a citlivostí ekvivalentní standardním metodám popsaným v Bacteriological Analytical Manual. Test umožní zjistit přítomnost salmonely ve vejcích za méně než 27 h, zatímco konvenčními metodami to trvá 10 dní. Vývoj PCR-metody je součástí „Federal egg safety programme“, který byl vyhlášen v červenci 2010.
Společnost vyvinula i další testy, které byly ověřeny standardizačními a certifikačními institucemi AOAC Int.( Association of Official Analytical Chemists) a/nebo AFNOR (Association française de normalisation) a které byly rovněž uznány úřadem FDA. Jedná se o detekci dalších kmenů salmonel, Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7.
Principem nové metody je automatická extrakce DNA a magnetická separace podle „Applied Biosystems MagMaxTM Express – 96 Magnetic Particle Processor“ a následné PCR (přes noc) podle „7500 Fast Real Time PCR System“. Testem nelze získat kvantitativní výsledky, ale relativní kvantifikaci lze provést porovnáním DNA v různých stupních koncentrace. Testovací kit bude možno dodávat v lyofilizované formě od konce r. 2011.
Systém založený na spotřebě kyslíku
Mocon Inc. (Minnesotta) ve spolupráci s Luxcel Biosciences Ltd. představili koncem r. 2010 přístroj „GreenLightTM900 Series“, který je k dispozici ve dvou variantách (model „960“ a „910“) pro velké a menší laboratoře. Na rozdíl od standardní aerobní kultivace na miskách, která je laboratorně náročná a pomalá (obvykle 48 h), stačí pro získání výsledků 8 h.
Metoda je založena na principu spotřeby kyslíku bakteriemi při jejich pomnožování a „dýchání“. Změny koncentrace kyslíku se měří podle hodnot fluorescence. Příprava vzorku je stejná jako pro kultivaci na miskách s agarem. Vzorek je zředěn pufrovaným peptonovým roztokem a homogenizován na přístroji Stomacher. Materiál citlivý na kyslík je pipetován do prohlubní podél mikrotitrační destičky kolem homogenizovaného zředěného vzorku. Destička je poté utěsněna minerálním olejem a umístěna do fluorescenční čtečky. Výsledky jsou automaticky generovány jako počet KTJ na gram nebo ml. V případě koncentrace bakterií 106 trvá měření ca 5 hodin, v případě koncentrace 105 trvá ca 8 hodin. Citlivost u modelu 910 je 102 KTJ/g ve 2 ml, resp. 101 KTJ/g v 15 ml. V případě modelu 960 je citlivost 103 KTJ/g.
Systém založený na emisi světla
Beacon Food Safety LLC, (Kolorado, USA), připravuje jednoúčelový nástroj o velikosti USB flash disku, který bude schopen provést 100 testů z kapky vzorku během 30 minut a bez časově náročné přípravy vzorku. Vzorek se umístí do kyvety a vloží do analyzátoru. Pokud je detekován biomarker patogenu, objeví se červené světlo. Test je údajně citlivější než dřívější testy tohoto typu.
Technologie BrightSpotTM kombinuje vysoce citlivý světelný senzor se světélkující bílkovinou z Gaussia luciferase pocházející z hlubokých moří. Vytváří ostře modré světlo, které je 10 000 ostřejší než světlo svatojánské mušky. Podstatou testu je kombinace ostrého světelného signálu a ultra-citlivého čipu obsahujícího 112 individuálně směrovaných optických detektorů.
Pro většinu bakteriálních a virových patogenů se používá detekce na úrovni molekul, pro detekci sérotypů E. coli se používá detekce bílkovin.
Food Technology, 2011, č. 4, s. 75-78
Objednávka kopie článku