MikroRNA (miRNA) jsou malé molekuly RNA, které neobsahují genetickou informaci pro tvorbu bílkovin, ale hrají důležitou roli v regulaci genů. Podílejí se například na vývoji rostlin, reakcích na stres a metabolismu. Vědci již dlouho studují miRNA, ale jejich úprava pomocí genetických metod byla složitá, protože jsou velmi malé. Proto je důležité vybrat správný CRISPR systém, který umožní efektivní vypnutí (knockout) těchto genů.

Při výzkumu vědci zjistili, že technologie Cas12a vedla k vytvoření mutantních semen, která nebyla schopna vyklíčit, zatímco u některých rostlin upravených Cas9 se objevily delší postranní kořeny, ale bez výhonků. Celkem se podařilo úspěšně deaktivovat devět miRNA genů v rýži pomocí CRISPR-Cas12a, což naznačuje, že tato technologie je účinnější při vytváření nefunkčních verzí těchto genů.

CRISPR-Cas9 se v posledních letech hojně využívá pro úpravu miRNA genů, ale často vytváří malé změny v DNA, které nemusí vést k úplnému vypnutí genu. Naproti tomu Cas12a způsobuje větší odstranění částí DNA (> pět bází), což výrazně narušuje strukturu pre-miRNA (prekurzor miRNA) a zabraňuje tvorbě zralé miRNA. Studie zaměřená na gen OsMIR390 v rýži potvrdila, že Cas12a je při vypínání miRNA genů účinnější než Cas9.

Výzkum ukázal, že zatímco Cas12a byla méně účinná při přenosu genetické úpravy do rostlin než Cas9, vedla k větším změnám v DNA, které spolehlivě vyřadily miRNA geny z funkce. To naznačuje, že Cas12a je lepší volbou pro cílenou mutaci miRNA genů.

Aby vědci ověřili účinnost Cas12a, zvolili dalších devět miRNA genů v rýži s různou úrovní aktivity. Výsledky ukázaly, že mutace vytvořené Cas12a odpovídají nefunkčním verzím genů (null alely). Analýza mutantních rostlin přinesla nové poznatky o tom, jak miRNA ovlivňují velikost a kvalitu semen, obsah škrobu a růst sazenic, což potvrzuje jejich zásadní roli v regulaci vývoje rostlin. Podrobné zkoumání genové aktivity ukázalo, že knockout miRNA genů pomocí Cas12a má jen minimální dopad na ostatní miRNA, ale výrazně ovlivňuje aktivitu jiných genů.

Celkově tato studie ukázala, že CRISPR-Cas12a je účinnější než Cas9 při tvorbě nefunkčních verzí miRNA genů v rostlinách a přispěla k lepšímu pochopení jejich role. Vědci navrhují využití této technologie k vytvoření knihoven miRNA mutantů nejen u rýže, ale i u dalších rostlinných druhů, což by mohlo vést k významnému pokroku v genetickém inženýrství plodin.
 

Zdroj:
Zheng, Xuelian, et al. „An efficient CRISPR‐Cas12a‐mediated MicroRNA knockout strategy in plants.“ Plant Biotechnology Journal 23.1 (2025): 128-140.
https://www.isaaa.org/kc/cropbiotechupdate/article/default.asp?ID=21038

Zdroj článku: BIOTRIN